有益な N を含む組換えヒト IgG1 Fc の生産

Communications Biology volume 6、記事番号: 589 (2023) この記事を引用

302 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

静脈内免疫グロブリン (IVIG) は、自己免疫疾患の治療に使用される血漿由来のポリクローナル IgG です。 研究では、Fc の α-2,6 シアル化が抗炎症活性を向上させることが示されています。 また、Fc のアフコシル化は、この受容体に対する一価の親和性を高めることで FcγRIIIA を効率的にブロックし、難治性免疫性血小板減少症 (ITP) の治療に有益となる可能性があります。 今回我々は、肝臓でヒトIgG1 Fcを合成し、α-2,6シアル化および低フコシル化ヒトIgG1 Fc（rhIgG1 Fc）を血清と卵黄に分泌するゲノム編集ニワトリを作製した。 また、rhIgG1 Fc は市販の IVIG よりも FcγRIIIA に対して高い親和性を持っています。 したがって、rhIgG1 Fcは、免疫複合体媒介FcγRIIIA架橋およびその後のADCC応答を効率的に阻害します。 さらに、rhIgG1 Fcは受動的ITPモデルにおいて抗炎症活性を発揮し、ニワトリ肝臓由来rhIgG1 FcがIVIGの有効性を再現することに成功したことが実証された。 これらの結果は、ゲノム編集ニワトリが、抗炎症活性に有益な N-グリコシル化パターンを備えた rhIgG1 Fc の生産プラットフォームとして使用できることを示しています。

自己免疫疾患 (AD) は、自己抗原に対する異常な免疫応答によって引き起こされます1。 一般に、自己抗原を認識する自己抗体は、マクロファージ、好中球、ナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞を活性化することによって炎症反応を引き起こし、組織や細胞の破壊を引き起こします2。 したがって、AD を治療するには、エフェクター細胞の活性化を阻害し、炎症反応を弱めることが重要です。 抗炎症剤の静脈内免疫グロブリン (IVIG) は、炎症性 AD の治療に広く使用されています 3。 IVIG を高用量 (つまり 1 ～ 2 g/kg) で注入すると、免疫性血小板減少症 (ITP) 患者の炎症を改善し、血小板数を回復できます4。 IVIG は多数の AD に対して抗炎症作用を示すため、世界的な需要は継続的に増加しています5。 しかし、IVIG は寄付されたヒト血漿から調製されるため、供給不足と高コストが大きな制限となります6。 したがって、血漿由来 IVIG の抗炎症活性を再現する IVIG 代替品の生産および供給のための効率的なシステムを開発することが望ましい。

IVIG はさまざまなメカニズムを介して作用しますが、その Fc フラグメントは抗炎症活性に重要です 7、8、9。 α-2,6 シアル化 Fc は、IL-33 や IL-4 などの TH2 サイトカインの分泌を促進することにより、エフェクター マクロファージにおける FcγRIIB の発現を促進することが知られており、α-2,6 シアル化 Fc の豊富な比率により抗抗炎症作用が増加します。 IVIG の炎症活性は顕著です10、11、12、13、14、15。 したがって、高度にα-2,6 シアル化された Fc は、抗炎症活性の向上を示す潜在的な IVIG 代替品となります。

IVIG の活性の根底にある他の主要なメカニズムは、活性化 Fcγ 受容体 (FcγR) の競合的遮断です 7,16。 IVIG が高用量で投与されると、IVIG は活性化 FcγR を占有し、免疫複合体がこれらの受容体に結合して架橋するのを防ぎます 17,18。 特に、IVIG の抗炎症活性は FcγRIIIA 依存性であり、FcγRIIIA の遮断が IVIG 活性の潜在的なメカニズムであることが示唆されています 19、20、21。 この概念は、FcγRIIIAの架橋により有害な副作用が生じるものの、モノクローナル抗体によるFcγRIIIAの遮断がIVIG活性を再現し、難治性ITP患者の炎症反応を効率的に改善することを示す研究によって裏付けられています22。 コアのフコシル化（アフコシル化）が存在しないと、FcγRIIIA23 に対する IgG の一価の親和性が大幅に増加するため、アフコシル化された Fc は効率的に FcγRIIIA を占有し、抗炎症活性の誘導や難治性 ITP の治療に有益であると推測できます。 最近、NK 細胞の FcγRIIIA がアフコシル化 IgG24 によって豊富に占められていることが証明されました。 さらに、アフコシル化された抗原非特異的抗体は FcγRIIIA を効率的に遮断し、抗原特異的抗体の Fc エフェクター機能を阻害することで抗炎症性を発揮できることが示されました 25。

したがって、高レベルのα-2,6 シアル化 N-グリカンを有し、同時にアフコシル化を介して FcγRIIIA に対する高い親和性を有する hIgG1 Fc 領域を生成できれば、IVIG の複数の作用機序を誘発し、抗抗炎症性を改善することができます。炎症活動。 しかし、血漿由来 IVIG にはシアル化 Fc が少量含まれ (全 N-グリカンの約 10%)、フコシル化 N-グリカンが大部分を占めます 26。 哺乳類細胞培養物由来の組換え hIgG1 Fc も、発現細胞株に特別な改変を加えない限り、シアル化グリカンのレベルは低く、フコシル化グリカンのレベルは高くなっています 27。 したがって、抗炎症活性が強化されたIVIG代替薬の開発には、α-2,6シアル化およびアフコシル化N-グリカンを高割合で含むhIgG1 Fcを産生するための代替系が必要である。

鶏はバイオ医薬品を生産するための効率的なプラットフォームです。 これは、鶏卵には豊富なタンパク質が含まれており、鶏は年間 300 個以上の卵を産むためです28。 また、鶏卵タンパク質のグリコシル化パターンはヒトタンパク質のグリコシル化パターンと類似しており、さらに重要なことに、ニワトリはヒトのようなグリカンのみを生成し、免疫原性のα-ガラクトースおよびNeu5Gcを生成しないことです28,29。 これらの理由から、卵、特に卵白におけるバイオ医薬品の蓄積を増加させるためのさまざまなアプローチが研究されています 30,31,32,33,34,35,36,37。 一方、卵黄タンパク質の大部分は肝臓から合成され、卵黄が卵巣内で成熟し始めるときに血流から運ばれます。 鶏レバーは高レベルのα-2,6 シアリルトランスフェラーゼ (ST6GAL1) を発現しますが、鶏レバーのフコシルトランスフェラーゼ (FUT8) のレベルは非常に低いと考えられます。 これは、卵黄タンパク質のほとんどの N-グリカンがアフコシル化されているためです 38,39。 したがって、鶏レバーで合成されたタンパク質は、高度にα-2,6 シアル化およびアフコシル化された N-グリカン構造を有しており、これらのタンパク質は血流中を循環し、最終的には卵黄に蓄積すると予想されます 40。 したがって、hIgG1 Fcを鶏肝臓特異的な方法で合成できれば、高レベルのα-2,6シアル化およびアフコシル化を有するhIgG1 Fcを血清および卵黄から得ることができ、これは抗炎症活性に有益となるであろう。

今回我々は、肝臓特異的にヒトIgG1 Fcを分泌するゲノム編集ニワトリの開発を報告する。 これを行うために、我々は、主要な血清タンパク質であり肝臓で発現されるアルブミン（ALB）遺伝子にヒトIgG1 Fcコード配列をタグ付けし、ゲノム編集ニワトリ（以下、ALB::hIgG1 Fcニワトリと呼ぶ）を作製した。 。 タグ付けには、ALB と IgG1 Fc コード配列の間のテセアシグナ ウイルス (T2A) の自己切断 2A ペプチドを使用しました。これにより、翻訳後に IgG1 Fc を ALB から分離できます。 この戦略を使用して、我々は高度にα-2,6 シアル化およびアフコシル化されたヒト IgG1 Fc を鶏血清中で、そして最終的には卵黄中で効率的に生成しました。 ALB::hIgG1 Fc ニワトリ由来の組換えヒト IgG1 Fc (rhIgG1 Fc) は、FcγRIIIA 遮断活性を改善し、生体内での IVIG の抗炎症活性を再現することに成功しました。 したがって、我々はここで、肝臓特異的様式でhIgG1 Fcを発現するゲノム編集ニワトリが、ヒト血漿に代わるIVIG供給源となり得ることを示す。

血清および卵黄中に rhIgG1 Fc を蓄積するために、以前に報告されているように、白色レグホン (WL) 始原生殖細胞 (PGC) で CRISPR/Cas9-NHEJ 媒介ゲノム編集技術を使用してアルブミン (ALB)::hIgG1 Fc ゲノム編集ニワトリを生成しました。 、42。 hIgG1 Fc コード配列 (CDS) を ALB 遺伝子に導入するために、ALB 遺伝子のイントロン 13 を認識する CRISPR/Cas9 プラスミドと、ALB のイントロン 13 とエクソン 14 (終止コドンなし) を含むドナー プラスミドを構築しました。遺伝子、その後に T2A 配列と、hIgG1 ヒンジと CH2 および CH3 ドメインを含む hIgG1 Fc CDS が続きます (図 1a)。 T2A は、翻訳中のペプチド結合形成の欠落を誘導するウイルス 2A 自己切断ペプチドの 1 つであり、これにより 2 つの異なるタンパク質の同時発現が可能になります 43。 2A ペプチドの切断効率は 100%ではありませんでしたが 44、ALB の形成と分泌に影響を与えることなく T2A を使用して ALB から rhIgG1 Fc を分離し、それによって ALB の枯渇によって引き起こされる未知の有害な影響を防ぐことを目的としました。

a アルブミン (ALB) 遺伝子にタグ付けするためのヒト IgG1 Fc (hIgG1 Fc) コード配列を含むドナー プラスミドの概略図。 ドナーベクターには、ALB イントロン 13、停止コドンのない ALB エクソン 14、T2A 配列、ALB シグナルペプチド (sig pep) コード配列、hIgG1 Fc コード配列、ALB 3' UTR、およびピューロマイシン耐性 (PuroR) が含まれます。遺伝子。 ドナーベクターと、ALB イントロン 13 を標的とするシングルガイド RNA (sgRNA) を始原生殖細胞 (PGC) に同時トランスフェクトすると、ドナー ベクターが sgRNA 標的部位に挿入されました。 得られた改変対立遺伝子は、終止コドンのないALBエクソン14、T2Aコード配列、ALBシグナルペプチドコード配列、およびhIgG1 Fcコード配列を含む。 b 5' ジャンクションおよび 3' ジャンクションに特異的なプライマーを使用したピューロマイシン選択後の PGC のノックイン (KI) 検証。 c ゲノム編集された PGC の 5' ジャンクションおよび 3' ジャンクションの 3 つの TA クローン化 PCR 産物の配列分析。 d 検定交配によるドナーPGC由来子孫の生産。 e 3つのALB::hIgG1 Fcゲノム編集G1子孫の5'接合部および3'接合部の3つのTAクローン化PCR産物の配列分析。

CRISPR/Cas9 およびドナープラスミドのトランスフェクション後、ゲノム編集された PGC がピューロマイシン選択によって選択されました。 選択された PGC へのドナー プラスミドの組み込みは、PCR および内因性プラスミド配列とドナー プラスミド配列の間の 5' および 3' 接合部の配列分析によって検証されました。 これにより、ドナープラスミドがいくつかの挿入欠失を伴って標的部位に正常に組み込まれたことが確認されました（図1b、c）。 これらの樹立されたゲノム編集 WL PGC を韓国オゲ (KO) レシピエント胚に移植しました。 性成熟後、2頭のレシピエントKO雄を野生型WL雌鶏と試験交配し、ドナーPGC由来のG1子孫を孵化させた（図1dおよび補足表1）。 ドナー PGC 由来 G1 子孫から、ドナー プラスミドの組み込みが 5' および 3' 接合部特異的 PCR およびゲノム DNA の配列分析によって検証された ALB::hIgG1 Fc 子孫を得ました。 ゲノム編集された子孫では、ドナープラスミドは、5'および3'接合部位の両方に1塩基対の挿入変異を伴って正常に組み込まれました（図1e）。

次に、1 羽の性的に成熟したヘテロ接合性 G1 雄鶏 (ALB+/hIgG1 Fc) を野生型雌鶏 (ALB+/+) と交配させ、G2 ALB::hIgG1 Fc の子孫 (ALB+/hIgG1 Fc) を孵化させました。 性的成熟後、これらのヘテロ接合性 G2 子孫が交配され、G3 子孫が正常に孵化しました。 G3 子孫の遺伝子型解析により、ホモ接合性 ALB::hIgG1 Fc 子孫 (ALB hIgG1 Fc/hIgG1 Fc) がメンデル遺伝に従って正常に生成されたことが確認されました (補足図 1a、b)。 血清中のALB濃度はホモ接合性鶏で減少する傾向を示しましたが、ホモ接合性鶏も血中にALBを分泌し、健康で性成熟に達し、卵を産むことが観察されました（補足図2a〜c、e）。 これらの結果は、ALB::hIgG1 Fc ニワトリが首尾よく作製でき、性成熟に達して卵を産むことを実証している。

ALB::hIgG1 Fc ニワトリにおける hIgG1 Fc 転写物の発現パターンを同定するために、いくつかの臓器から RNA を抽出し、RT-PCR によって hIgG1 Fc 転写物の発現を確認しました。 その結果、肝臓におけるrhIgG1 Fc転写物の強力な発現が確認され（図2a）、これはrhIgG1 Fcが肝臓特異的な様式で首尾よく転写されたことを示唆しています。

a 野生型およびALB::hIgG1 Fc ゲノム編集ニワトリから得たいくつかの器官からの組織のRT-PCRによるhIgG1 Fc転写物の発現の検証。 b ALB::hIgG1 Fc ゲノム編集ニワトリの血清および卵黄への rhIgG1 Fc 分泌のウエスタンブロッティングによる検証。 β-メルカプトエタノールをサンプルに添加して、ジスルフィド結合を切断しました（還元条件）。 野生型ニワトリ血清を陰性対照として使用した。 c 孵化後4、18、および40週間のヘテロ接合性ALB+/hIgG1 Fcニワトリからの血清中のrhIgG1 Fcの濃度。 各点は個々の鶏を表します。 （独立したサンプルの n = 5 ～ 12） d 孵化後 24、30、および 36 週間のヘテロ接合性 ALB+/hIgG1 Fc 卵黄中の rhIgG1 Fc の濃度。 各ドットは個々の卵黄を表します。 (n = 6 ～ 8 の独立したサンプル) グループ間の差異は、一元配置分散分析によって決定されました。 ns、重要ではありません。 エラーバーは標準偏差を表します。

次に、血清と卵黄をサンプリングし、ウェスタンブロッティングによってrhIgG1 Fcの分泌を検証しました（図2b）。 データにより、血流および卵黄への hIgG1 Fc の分泌が確認されました (図 2b)。 非還元条件下では、rhIgG1 Fc ((CH2 + CH3)2) と一致するバンドが血清と卵黄の両方で検出されました。 還元条件下では、約 35 kDa のバンドが検出されました。これは、脱グリコシル化された CH2 + CH3 の予想分子量 (25 kDa) よりも大きくなっています (図 2b)。 この結果は、rhIgG1 Fcがグリコシル化された形で血清および卵黄に分泌されることを示しています。 興味深いことに、血清では、還元条件下で約 110 kDa の大きなバンド (ALB + T2A + CH2 + CH3 の分子量と一致) が検出され、ALB-Fc 融合体 (> 100 kDa の大きなバンド) も検出されました。 ）非還元条件下では、T2A切断が完全には行われなかったことを示唆しています（図2b）。 血清とは対照的に、還元条件および非還元条件の両方で卵黄では rhIgG1 Fc のみが検出されました (図 2b)。

次に、G2 ヘテロ接合性 ALB+/hIgG1 Fc 鶏の血清および卵黄中の rhIgG1 Fc 濃度をチェックしました。 孵化後 4、18、および 40 週間後のヘテロ接合性 ALB+/hIgG1 Fc 子孫の血清中の平均 rhIgG1 Fc 濃度は、170.70 ± 71.65 (n = 8) μg/ml、162.98 ± 27.34 (n = 12) μg/ml、それぞれ149.39±42.34μg/ml（n = 5）でした（図2c）。 G2 ヘテロ接合性 ALB+/hIgG1 Fc 鶏の卵黄中の rhIgG1 Fc 濃度は、平均 152.85 ± 85.87 (n = 7) μg/ml、149 ± 45.52 (n = 8) μg/ml、および 143.89 ± 55.57 (n = 7) μg/ml を示しました。 6）それぞれ24、30、および36週間後のμg/ml（図2d）。 また、我々は、rhIgG1 Fcが、数世代の子孫に関係なく、継続的に血流に分泌されることを確認しました（補足表2）。 さらに、rhIgG1 Fcもホモ接合性ALBhIgG1 Fc / hIgG1 Fc鶏の血清および卵黄にも分泌および蓄積されることが観察されました（補足図2dおよびe）。 これらの結果は、ALB::hIgG1 Fc ニワトリが rhIgG1 Fc を血清および卵黄に効率的に分泌することを示しています。

ALB::hIgG1 Fc ニワトリ由来の rhIgG1 Fc 上の N-グリコシル化のパターンを調べるために、プロテイン A アフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、血清および卵黄から rhIgG1 Fc を精製しました。 rhIgG1 Fc は血清と卵黄の両方から首尾よく精製されました。 (図3a)。 次に、PNGase F による消化によって N-グリカンを除去し、UPLC-MS/MS によって分析しました。 血清から精製された rhIgG1 Fc の場合、6 種類の N-グリカンが同定され、すべてがバイアンテナ型でアフコシル化された複合体型でした（図 3b-d）。 この N-グリカン プロファイルから、個々の N-グリカンの割合を決定しました (表 1 および 2)。 若い雌鶏と雄鶏の血清には約 2.5% の脱ガラクトシル化 G0 グリコフォームが含まれていましたが、N-グリカンの大部分は末端がガラクトシル化およびシアル化されていました (図 3b および表 1)。 これらのうち、末端シアル酸残基を含む幼若女性および男性血清中の N-グリカンの総組成は、それぞれ 36.01% および 39.00% でした (表 1)。 同様に、成人女性と男性の両方の血清には、脱ガラクトシル化されたG0グリコフォームが約3.3％で存在し、末端シアル酸がそれぞれ約28.66％と34.44％で存在しました（図3cと表1）。 これらの結果は、ALB::hIgG1 Fc ニワトリがより高いレベルのシアル化およびアフコシル化された rhIgG1 Fc を血清中に分泌することを示しています。

プロテインAカラムおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、rhIgG1 Fcを血清および卵黄から精製した。 精製されたｒｈＩｇＧ１ Ｆｃを１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で泳動し、次いでクーマシーブリリアントブルー溶液で染色した。 b UPLC-MS/MSで分析した、24週および40週の幼若血清、c 成人血清、およびd 卵黄から精製されたrhIgG1 FcのN-グリコシル化プロファイル。 e 血清および卵黄から精製した rhIgG1 Fc のニワトコ (SNA) レクチンおよび Maackia amurensis レクチン II (MAL II) ブロット。 α-2,3 シアル酸のみを有する CHO 細胞由来の組換えエリスロポエチン (EPO) を、SNA ブロットのネガティブ コントロールおよび MAL II ブロットのポジティブ コントロールとして使用しました。

次に、24週目と40週目の卵黄から精製したrhIgG1 Fcを分析しました。 当初、卵黄タンパク質は血清から輸送されるため、卵黄中のrhIgG1 FcのN-グリカンプロファイルは血清中のものと同じであると予想されました。 主要な N-グリカン タイプは血清中のものと同じでしたが、さらに 5 つのマイナーな N-グリカン タイプ、A3G1F、M3G1S1、M5A1S1F、A3G2S1F、および M9 を特定しました。 これらは、24週目と40週目の卵黄中の総N-グリカンのそれぞれ6.04％と10.99％を占めていました（図3dおよび表2）。 これらのうち、コアのフコシル化 N-グリカンは、24 週間および 40 週間で、それぞれ合計 N-グリカンの 3.53% および 5.71% として存在しました (表 2)。 末端シアル酸残基を含むrhIgG1 Fc N-グリカンの割合は、24週間および40週間でそれぞれ32.07%および30.77%でした(表2)。 これらの結果は、卵黄中のrhIgG1 FcのN-グリカンプロファイルが血清中のプロファイルとほぼ同じであるが、いくつかの小さな違いがあることを示しています。

次に、hIgG1 Fc11 の抗炎症活性の基礎となる主要な因子の 1 つである末端シアル酸とガラクトース残基の間の主要な結合タイプを同定するために、HRP 標識ニワトコレクチン (SNA) および Maackia amurensis を使用してレクチンブロッティングを実行しました。レクチン II (MAL II)、それぞれα-2,6-結合シアル酸残基およびα-2,3-結合シアル酸残基に特異的に結合します。 SNA ブロットにより、血清と卵黄の両方の rhIgG1 Fc に対する強いシグナルが明らかになりました。 しかし、MAL II ブロットは、血清と卵黄の両方の rhIgG1 Fc について無視できるシグナルを示し、主要な結合タイプが α-2,6 であることを示唆しています (図 3e)。 これらの結果は、高レベルのα-2,6 シアル化およびアフコシル化 rhIgG1 Fc が ALB::hIgG1 Fc ニワトリによって効率的に合成され、血清と卵黄の両方から精製できることを示しています。

さらに、ALB::hIgG1 Fc、ニワトリ由来のrhIgG1 Fc、HEK293T細胞由来の組換えFc、およびIVIGの血清半減期をC57BL/6マウスで分析した。 その結果、ALB::hIgG1 Fc ニワトリ由来 rhIgG1 Fc および HEK293T 細胞由来の組換え Fc の半減期は、それぞれ 39.14 時間および 36.37 時間と決定されました（補足図 3）。

IgG1 のさまざまな生物学的活性は、その Fc 領域と Fcγ 受容体 (FcγR) との相互作用によるものであるため、rhIgG1 Fc のヒト I 型 Fcγ 受容体 (FcγRIA、FcγRIIA、および FcγRIIIA) への結合の解離定数 (KD) を測定しました。樹状細胞特異的 ICAM は、表面プラズモン共鳴 (SPR) によって非インテグリン (DC-SIGN) (α-2,6-シアル化 Fc の受容体) および FcRn を捕捉します。 rhIgG1 FcのFcRn、FcγRIA、およびFcγRIIIAへの結合のKD値は、それぞれ9.088×10-9、1.275×10-9、および9.980×10-9Mでした（図4a）。 ただし、rhIgG1 FcのFcγRIIAおよびDC-SIGNへの結合のKD値は、主に非特異的結合と低い親和性により決定できませんでした（補足図4および表3）。 さらに、市販の IVIG の FcRn、FcγRIA、および FcγRIIIA への結合の KD 値を測定しました。これらは、それぞれ 2.142 × 10−8、2.480 × 10−9、および 2.870 × 10−7 M でした（図 4a）。 。 評価された KD 値から、rhIgG1 Fc の FcγRIA および FcRn に対する親和性は、市販の IVIG の親和性よりもそれぞれ 1.94 倍および 2.35 倍高いことが確認されました (表 3)。 特に、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するｒｈＩｇＧ１ Ｆｃの親和性は、市販のＩＶＩＧの親和性よりも２８．７５倍高かった（表３）。 これらの結果は、ｒｈＩｇＧ１ Ｆｃが、おそらくその高レベルのアフコシル化のため、ＦｃγＲＩＩＩＡに対してＩＶＩＧよりも著しく高い一価の親和性を有することを示唆している。

a IVIG および rhIgG1 Fc の FcRn、FcγRIA、および FcγRIIIA への結合を示すセンサーグラム (Biacore 分析)。 結合は、FcRnの定常状態平衡モデル、およびFcγRIAおよびFcγRIIIAの単一サイクル動態を使用して評価されました。 KD 値は各センサーグラムに注釈が付けられます。 b IVIGおよびrhIgG1 Fcの存在下でのWIL2-SヒトBリンパ芽球に対する抗CD20抗体の抗体依存性細胞傷害(ADCC)。 エフェクター細胞としてFcγRIIIAを発現するJurkat細胞を加え、ルシフェラーゼ活性を測定することでADCC活性を評価した。 c IVIGおよびrhIgG1 Fcの存在下でのラージヒトリンパ腫細胞に対する抗CD20抗体の抗体依存性細胞食作用（ADCP）。 FcγRIIAを発現するJurkat細胞をエフェクター細胞として使用し、ルシフェラーゼ活性を測定することでADCP活性を評価した。 (n = 3 の独立したサンプル) グループ間の差異は、一元配置分散分析によって決定されました。 ns、重要ではありません。 * P < 0.05; および *** P < 0.001。 エラーバーは標準偏差を表します。

免疫複合体による FcγRIIIA の架橋は免疫細胞を刺激して炎症性サイトカインを分泌させ、組織損傷を誘導するため、FcγRIIIA の遮断は強力な抗炎症戦略です。 実際、IVIG の抗炎症活性は、Fc 領域を介した FcγRIIIA の遮断によって媒介されます 19、21、45、46、47。 したがって、我々は、rhIgG1 Fcが免疫複合体を介したFcγRIIIAの架橋とそれに続く免疫細胞の活性化を阻害するかどうかを調べた。 これを行うために、我々は、IVIGまたはrhIgG1 Fcの存在下での抗CD20抗体のヒトFcγRIIIA媒介ADCC活性を調べた。 ヒト CD20 を発現する WIL2-S リンパ芽球細胞と、FcγRIIIA および活性化 T 細胞核因子 (NFAT) 応答エレメントによって駆動されるルシフェラーゼ レポーター遺伝子を発現するトランスジェニック Jurkat 細胞を、段階希釈した抗 CD20 抗体と共インキュベートしました。 IVIGまたはrhIgG1 Fcの存在下での抗体。 免疫複合体形成抗 CD20 抗体が Jurkat 細胞によって発現される FcγRIIIA に結合すると、FcγRIIIA の架橋が誘導され、NFAT 経路が活性化され、その結果ルシフェラーゼが発現します。

IVIGを1.8 mg/mlで添加した場合、抗CD20抗体のEC50値は83.36 ng/mlで、これはPBS処理グループで測定された値よりも3.46倍高かった(図4b)。 これは、IVIGがFcγRIIIA遮断活性を有し、免疫複合体によって媒介されるFcγRIIIA架橋を妨げることを示した。 興味深いことに、rhIgG1 Fcを1.8 mg/ml IVIGと同じモル比の600 μg/mlで添加した場合、抗CD20抗体のEC50値は2218.19 ng/mlで、IVIGのEC50値より26.60倍高かった。 -治療群（図4b）。 この変化倍率の違いは、FcγRIIIAに対するIVIGおよびrhIgG1 Fcの親和性の違いと一致している(図4aおよび表3)。 rhIgG1 Fcの濃度が減少すると、EC50値は比例して増加しました（図4b）。 これらの結果は、rhIgG1 FcがFcγRIIIAの占有に関して市販のIVIGより優れており、この受容体への免疫複合体の結合を効果的にブロックすることを示している。

また、我々は、FcγRIIAおよびNFAT応答エレメントによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するトランスジェニックJurkat細胞を用いて、rhIgG1 FcがADCPの主要な誘導因子であるFcγRIIAをブロックすることを確認しようと試みた。 CD20発現Raji細胞およびトランスジェニックJurkat細胞を、1.8mg/mlのIVIGまたは0.6mg/mlのrhIgG1 Fcの存在下で段階希釈した抗CD20抗体とともに共インキュベートした。 ADCP 誘導レベルは、各グループのルシフェラーゼ活性を測定することによって検査されました。 しかし、1.8 mg/ml IVIGおよび0.6 mg/ml rhIgG1 Fc治療群の両方において、免疫複合体化抗CD20抗体によって媒介されるFcγRIIA架橋に対する阻害効果は検出されませんでした（図4c）。 この結果は、FcγRIIIAよりもFcγRIIAに対するIVIGおよびrhIgG1 Fcの親和性が比較的低いことと一致している（表3および補足図4）。

rhIgG1 Fcが自己抗体媒介血小板枯渇をブロックするかどうかを検証するために、マウス血小板特異的インテグリンαIIbβ348を認識するラットモノクローナル抗体（MWReg30）の注射によって血小板が枯渇する受動的ITPマウスモデルを使用しました。 抗血小板抗体MWReg30注射の2時間前にIVIGまたはrhIgG1 Fcをマウスに投与し、MWReg30注射の4時間後に血小板数を分析しました（図5a）。 IVIGを1 g/kgおよび0.33 g/kgで投与した場合、MWReg30によって媒介される血小板減少が防止されました（図5b）。 同様に、rhIgG1 Fcを0.33 g/kgおよび0.12 g/kg（IVIGの1 g/kgおよび0.33 g/kgと同じモル比）で投与した場合も、血小板枯渇を防止しました（図5c）。 しかし、IVIGを0.1g/kgで投与した場合、MWReg30による血小板枯渇は防止されなかった(図5b)。 IVIGとは対照的に、rhIgG1 Fcを0.1 g/kg IVIGと同じモル比である0.033 g/kgで投与した場合、MWReg30による血小板枯渇を防止した(図5c)。 これらの結果は、rhIgG1 FcがMWReg30免疫複合体によって媒介される血小板枯渇を効率的にブロックすることを示しています。

a 受動的 ITP マウス モデルを使用した in vivo 実験の概略図。 抗血小板抗体ＭＷＲｅｇ３０（０．１μｇ／ｇ）の注射の２時間前に、マウスにＩＶＩＧまたはｒｈＩｇＧ１ Ｆｃの腹腔内注射を受けた。 MWReg30の注射の4時間後、尾静脈から血液を抽出し、血小板をリースアンドエッカー希釈液で染色し、位相差顕微鏡で計数した。 b 残留血小板数は、MWReg30 の注射後 4 時間で定量しました。MWReg30 自体は、IVIG (1 g/kg、0.33 g/kg、または 0.12 g/kg) の 2 時間後に注射されました。 各ドットは個々のマウスを表します。 (n = 4 ～ 7 の独立したサンプル)。 c 残留血小板数は、hIgG1 Fc (0.33 g/kg、0.12 g/kg、または 0.033 g/kg) の 2 時間後に投与された MWReg30 の注射の 4 時間後に定量されました。 (n = 5 ～ 7 の独立したサンプル)。 d 脾臓における内在性 CD4+/Foxp3+ Treg 集団の拡大を示す代表的なフローサイトメトリー プロット。 ＰＢＳ、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）、ｒｈＩｇＧ１ Ｆｃ（０．３３ｇ／ｋｇ）処置群からの脾臓を分析した。 e フローサイトメトリーによって分析した、6時間の治療後のPBS、IVIG (1 g/kg)、rhIgG1 Fc (0.33 g/kg)治療群からの脾臓のTreg集団パーセンテージ。 各ドットは個々のマウスを表します。 f 総 RNA を脾臓から単離し、IL-4、IL-33、および FcγRIIB mRNA レベルを測定するための定量的リアルタイム PCR に使用しました。 ＰＢＳ、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）、ｒｈＩｇＧ１ Ｆｃ（０．３３ｇ／ｋｇ）処置群からの脾臓を分析した。 (n = 3 の独立したサンプル) グループ間の差異は、一元配置分散分析および対応のある t 検定によって決定されました。 * P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001。 エラーバーは標準偏差を表します。

IVIG の α-2,6 シアル化 IgG1 Fc は、制御性 T 細胞 (Treg) 集団を拡大し、TH2 サイトカイン IL-33 および IL-412,13 を介して FcγRIIB の発現を促進することによって抗炎症活性を発揮するため、rhIgG1 Fc も同様であるかどうかを調べました。脾臓における Treg 集団と IL-33、IL-4、および FcγRIIB の発現を調べることにより、α-2,6 シアル化 IgG1 Fc の抗炎症活性を再現します。 結果により、CD4+/Foxp3+制御性T細胞集団は、IVIGおよびrhIgG1 Fcグループの両方で6時間の処理後に増加する傾向があることが確認されましたが、統計的に有意には達しません（図5d、e）。 さらに、IL-33、IL-4、およびFcγRIIBの発現がIVIGおよびrhIgG1 Fc治療群で有意に増加したことを確認しました（図5f）。 これらの結果は、ニワトリ由来のrhIgG1 FcがTH2サイトカインおよびFcγRIIBの発現を促進し、それによってIVIGにおけるα-2,6シアル化IgG1 Fcによって媒介される抗炎症活性の機構を再現することに成功したことを示している。

今回、我々は血清と卵黄中にrhIgG1 Fcを産生するゲノム編集ニワトリを開発した。 我々は、ALB::hIgG1 FcニワトリがrhIgG1 Fcを血清および卵黄に分泌すること、およびALB::hIgG1 Fcニワトリ由来のrhIgG1 Fcが機能的な抗炎症剤であることを示す。 また、我々は、ゲノム編集ニワトリが、抗炎症活性が強化されたIVIG代替品を生産するための効率的なプラットフォームとして使用できることを示唆した。 さらに、我々は、鶏肝臓で主に発現される主要な血清タンパク質をコードする遺伝子を標的とすることが、高度にガラクトシル化、α-2,6シアル化およびアフコシル化されたバイオ医薬品を血清および卵黄中に蓄積させるための効率的なアプローチであることを示唆した。

我々は、ALB::hIgG1 Fc ニワトリが肝臓で hIgG1 Fc 転写物の優勢な発現を示し、ALB::hIgG1 Fc ニワトリ由来の hIgG1 Fc が保有する N-グリコシル化パターンが高レベルの α-2,6 シアル化と低レベルのフコシル化。 特に、シアリル化された N-グリカンは全 N-グリカンの約 30% を占めていました。 hIgG1 Fc がその構造上、ほとんどシアル化されていないタンパク質であることを考慮すると、これは非常に効率的なシアル化率です 49。 一般に、哺乳類の発現系から産生されたヒト IgG1 は Fc をほとんどシアリル化しておらず、ヒト血漿由来の天然ヒト IgG1 はシアリル化率が低い (総 N-グリカンの約 10%) 26,27。 また、哺乳類の発現系から産生されたヒト IgG および血漿由来の天然ヒト IgG1 には、高レベルのコアフコシル化 Fc26、27 が含まれています。 したがって、ALB::hIgG1 Fc ニワトリは、豊富な末端シアル化と低レベルのフコシル化を備えた hIgG1 Fc を生産するためのユニークなシステムです。 さらに、ALB::hIgG1 Fc ニワトリ由来の rhIgG1 Fc の末端シアル酸残基は主に α-2,6 結合しており、これは抗炎症活性の誘導に重要であることを確認しました 11。 したがって、ニワトリバイオリアクターは、抗炎症活性を誘導するための有益な N-グリカンを含む hIgG1 Fc を生産するための効率的なプラットフォームです。

我々のN-グリコシル化パターン分析により、卵黄由来のrhIgG1 Fc中に、もともと血清中に同定されていなかった微量のN-グリカンが検出されました。 この結果は、血清 IgY では未確認だったいくつかの N-グリカンが卵黄 IgY で検出されたことを示す以前の報告と一致しています。 したがって、タンパク質が血清から卵黄に輸送されるときに、N-グリカンに対する小さな修飾が行われると考えられます50。 また、我々は、卵黄中にALB-Fc融合タンパク質を検出しなかった（元々は血清中で検出されたが）。これは、未プロセシングのALB-Fc融合タンパク質が卵黄に移行しなかったか、または融合パートナーからのFcの切断が卵黄中に起こったことを示唆している。以前に報告された輸送プロセス33。

ヒト FcγR に対する rhIgG1 Fc の親和性を分析したところ、rhIgG1 Fc はフコシル化レベルが低いため、FcγRIIIA に対して著しく高い親和性を有することがわかりました。 したがって、rhIgG1 Fc は、市販の IVIG よりも強力に免疫複合体によって媒介される FcγRIIIA 架橋を阻害しました。 これらの結果は、rhIgG1 Fcが一価の様式でFcγRIIIAを効率的に遮断することを示している。 モノクローナル抗体によるFcγRIIIAの多価遮断は、IVIGの抗炎症活性を強力に再現し、難治性ITPにおいて有効性を示したにもかかわらず、FcγRIIIA架橋によって媒介される有害な副作用を誘発するため、これは重要である22,51。 最近の研究では、Fab フラグメントによる FcγRIIIA の一価遮断により、FcγRIIIA 架橋による毒性が回避されることが報告されました 47。 これと一致して、ALB::hIgG1 Fc ニワトリ由来の低フコシル化 hIgG1 Fc は、ヒト IVIG よりも高い親和性で FcγRIIIA を一価的に遮断し、関連する毒性を伴わずに抗炎症反応を誘導しました。 したがって、ニワトリのバイオリアクターシステムは、FcγRIIIA の遮断とその後の低フコシル化による抗炎症活性の強化を備えた hIgG1 Fc の最適な生産プラットフォームである可能性があります。

また、DC-SIGN はα-2,6 シアル化 Fc52 を認識する受容体として示唆されているため、rhIgG1 Fc は DC-SIGN に対してより高い親和性を有すると予想されます。 残念ながら、我々の SPR 分析設定では、ヒト DC-SIGN に対する IVIG および rhIgG1 Fc の親和性を測定できませんでした。 この結果は、フローサイトメトリーおよびSPR分析においてヒトDC-SIGNがα-2,6シアル化Fcに対して無視できる結合親和性を示したという最近の報告と一致している53。 シアル化FcとDC-SIGN間の親和性を測定するには、細胞ベースのELISAなどの他の方法が必要になる場合があります。

ゲノム編集ニワトリ由来のrhIgG1 Fcが生体内でも抗炎症活性を有することを確認するために、本発明者らはrhIgG1 Fcを受動ITPマウスモデルに投与した。 我々は、ゲノム編集ニワトリ由来のrhIgG1 Fcが、低用量でもこれらのマウスにおいて抗炎症活性を発揮することを発見した。 以前の報告では、Fc 領域における α-2,6 シアル化の増強が IVIG の抗炎症活性を有意に高めることが示されているため、ゲノム編集ニワトリ由来の rhIgG1 Fc の抗炎症活性の増強は、α-2,6 シアル化の増加によるものである可能性があります。血漿由来 IVIG10、11、12、54 よりも Fc が高い。 さらに、低フコシル化 rhIgG1 Fc も rhIgG1 Fc の抗炎症活性の向上に影響を与える可能性があり、この結果は、非フコシル化およびガラクトシル化 IgG が in vivo で抗炎症活性を向上させることを示す最近の研究と一致しています 55。

我々の研究では、IVIG と rhIgG1 Fc の両方が Treg 集団を拡大し、IL-33、IL-4、および FcγRIIB の発現を促進する傾向があり、ALB::hIgG1 Fc ニワトリ由来の hIgG1 Fc が抗炎症作用をうまく再現していることを示唆しています。 IVIGにおけるα-2,6シアル化IgG1 Fcの活性。 これらの結果に基づいて、我々はここで、ALB::hIgG1 FcニワトリがIVIG代替の供給源の1つとなる可能性を有し、供給不足に関連するIVIG療法の限界を解決するであろうことを示唆した。 さらに、我々は、ALB::hIgG1 Fc ニワトリ由来の組換えタンパク質の N-グリコシル化特性が、血液凝固因子などのヒト肝臓由来血液製剤の生産に最適であることを提案しました。これは、ヒト血液因子も高度に含まれる N-グリコシル化プロファイルを有するためです。 α-2,6 シアル化および低フコシル化型。これは鶏肝臓由来のタンパク質と同一です 56。 最後に、ニワトリはヒト以外のグリカンを生成しません。 したがって、ゲノム編集ニワトリは、ヒト化組換えヒト血液製剤の生産に最適なプラットフォームとなり得る。 そうでない場合、卵黄で生成される高度にガラクトシル化、シアル化、および低フコシル化されたグリコフォームは、Fc エフェクター機能 (CDC および ADCC 活性など) が強化されただけでなく、血清半減期も延長されたモノクローナル抗体をもたらす可能性があります 57。

結論として、我々は、主要な血清タンパク質遺伝子を標的としたニワトリバイオリアクターシステムが、血清および卵黄中にhIgG1 Fcを効率的に蓄積することを実証し、このアプローチは、最適なN-グリコシル化パターンを介して有効性が向上したさまざまなバイオ医薬品を製造するために広く適用される可能性があることを実証した。

ニワトリとマウスの管理と実験的使用は、ソウル大学の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました (SNU-190401-1-2 および SNU-210726-1-1)。 実験動物は、ソウル大学動物農場および実験動物資源研究所の標準管理プログラムに従って飼育されました。

ニワトリ ALB 遺伝子のイントロン 13 をターゲットとする CRISPR/Cas9 ベクターは、PX459 ベクター (Addgene プラスミド #62988) を使用して構築されました。 ガイド RNA (gRNA) 配列を CRISPR/Cas9 プラスミドに挿入するために、センスおよびアンチセンス オリゴヌクレオチドを設計および合成しました (Bioneer、大田、韓国)。 これらのオリゴヌクレオチドは、以下の熱サイクル条件下でアニーリングされました: 95 °C で 30 秒、72 °C で 2 分、37 °C で 2 分、および 25 °C で 2 分。 ALB 遺伝子の 3' 末端への hIgG1 Fc の標的タグ付けのために、ALB 遺伝子のイントロン 13 およびエキソン 14 と T2A、続いて hIgG1 Fc コード配列およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化部位を含むドナー プラスミドを pBHA で合成しました。ベクター バックボーン (Bioneer、大田、韓国)。 CRISPR/Cas9 ベクターの構築に使用したオリゴヌクレオチドを補足表 3 に示します。

PGC 系統確立のために、白色レグホン (WL) 雄 PGC を維持し、20% FBS (Invitrogen)、2% 鶏血清 (Sigma-Aldrich、St.Louis) を補充したノックアウト DMEM (Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド) 上で継代培養しました。 、MO)、1 × ヌクレオシド (Millipore、カリフォルニア州テメキュラ)、2 mM l-グルタミン、1 × 非必須アミノ酸、β-メルカプトエタノール、10 mM ピルビン酸ナトリウム、1 × 抗生物質 - 抗真菌剤 (Invitrogen)、およびヒト塩基性線維芽細胞の増殖因子（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。 ニワトリの PGC は、5% CO2、相対湿度 60 ～ 70% の雰囲気下、37 °C のインキュベーター内で培養されました。 PGC は、穏やかなピペッティングにより、マイトマイシン不活化マウス胎児線維芽細胞上で 5 ～ 6 日間隔で継代培養されました。 ニワトリ PGC でのゲノム編集では、CRISPR/Cas9 プラスミド (3 μg) とドナー プラスミド (3 μg) を、1 ml OptiMEM に懸濁した 6 μl のリポフェクタミン 2000 試薬とともに 1 × 105 個の培養 PGC に同時導入しました。 次に、トランスフェクションの 4 時間後、トランスフェクション混合物を PGC 培地に置き換えました。 ピューロマイシン (1 μg/ml) をトランスフェクションの 1 日後に培地に添加しました。 ピューロマイシン処理の 2 日後、選択した PGC を洗浄し、新鮮な PGC 培地に交換し、4 ～ 6 週間増殖させました。 ドナープラスミドの標的挿入は、ゲノム DNA PCR 分析によって確認されました。 この研究で使用したプライマーは補足表 3 にリストされています。

ゲノム改変ニワトリを作製するために、韓国オゲ（KO）レシピエント卵の鋭い端に窓を切り込み、3000個を超えるゲノム改変WL PGCをハンバーガーおよびハミルトンステージ14～17のレシピエント胚の背側大動脈に移植した。 。 卵窓をパラフィンフィルムで密閉し、孵化するまで卵の尖った端を下にして孵化させた。 孵化した雛は施設内の動物農場で育てられた。 性的成熟後、レシピエント雄鶏をWT雌鶏と交配させた。 ゲノム改変された子孫は、子孫の羽毛の色とその後のゲノム DNA 分析および配列決定に基づいて特定されました。

血清中のｒｈＩｇＧ１ Ｆｃを定量するために、ＡＬＢ＋／ｈＩｇＧ１ ＦｃおよびＡＬＢｈＩｇＧ１ Ｆｃ／ｈＩｇＧ１ Ｆｃニワトリの全血を採取し、血液凝固を防ぐために採取した血液に０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液を添加した。 収集した血液サンプルを 2000 rpm、10 分間、4 °C で遠心分離し、上清を収集して ELISA 分析に使用しました。 卵黄中のｒｈＩｇＧ１ Ｆｃを定量するために、４羽のＧ２ ＡＬＢ＋／ｈＩｇＧ１ Ｆｃニワトリから産まれた卵を収集し、卵黄を卵白から分離した。 収集した血清および卵黄サンプルを DW で希釈し、製造者の指示に従ってヒト IgG ELISA キット (ab100547、Abcam、ケンブリッジ、英国) を使用して ELISA によって定量しました。 標準 IgG 分子量を rhIgG1 Fc に調整するために、測定した濃度を 3 つに分割しました。

トランスジェニックニワトリ血清からヒト IgG1 Fc を精製するには、4 M 硫酸アンモニウムをニワトリ血清にゆっくりと加えました。 混合物を4℃で一晩撹拌し、次いで4℃で10,000gで30分間遠心分離した。 ペレットを元の血清量と等量の１×ＰＢＳに再懸濁した。 次いで、混合物を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に対して透析した。 サンプルをプロテイン A カラム (GE Healthcare Bio-Sciences、ウプサラ、スウェーデン) にロードし、タンパク質を 100 mM クエン酸 (pH 2.8) の勾配 100 ml で溶出しました。 タンパク質をさらに精製し、20 mM Tris-HCl、175 mM NaCl (pH 7.4) で事前平衡化した HiLoad Superdex 75 カラム (GE Healthcare Bio-Sciences) を使用するサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) によって分画しました。 卵黄からヒト IgG1 Fc を精製するには、卵黄を分離し、9 倍量の蒸留水で希釈しました。 サンプルを-20℃で一晩凍結し、室温で解凍しました。 解凍後、上澄み液を集めて濾過した。 次に、サンプルをプロテイン A カラム (GE Healthcare Bio-Sciences) にロードし、タンパク質を 100 mM クエン酸 (pH 2.8) の勾配 100 ml で溶出しました。

血清および卵黄中の rhIgG1 Fc のウェスタンブロットでは、ALB+/hIgG1 Fc ニワトリ血清を蒸留水 (DW) で希釈し、ALB+/hIgG1 Fc ニワトリ卵黄を、「ヒトの精製」に記載されている凍結融解法によって前処理しました。血清および卵黄切片からの IgG1 Fc。 野生型ニワトリ血清を対照として使用した。 調製したサンプルを 10% ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ポリフッ化ビニリデン膜 (Millipore、マサチューセッツ州ビレリカ) に転写しました。 転写後、ポリフッ化ビニリデン膜を 3% スキムミルクで室温で 1 時間ブロックしました (BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ)。 ブロックされた膜をヤギ抗ヒト IgG 一次抗体 (10319、Alpha Diagnostics、San Antonio、TX) とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 一次抗体を 0.1% PBST 緩衝液で 3 回洗浄し、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 結合ロバ抗ヤギ IgG 二次抗体 (sc-2020、Santa Cruz Biotechnology、ダラス、テキサス州、米国) とともに 1 時間インキュベートしました。室温で。 二次抗体を洗浄した後、ECL ウェスタンブロッティング基質 (GE Healthcare Bio-Sciences) を添加することにより、HRP 酵素活性を検出しました。

ALB::hIgG1 Fc ニワトリ由来の rhIgG1 Fc の N-グリカン分析を UPLC/MS-MS によって実行しました。 簡単に言うと、精製したrhIgG1 FcをPNGase Fとともに37℃で16時間インキュベートしました。 脱グリコシル化されたrhIgG1 Fcをエタノールを使用して沈殿させ、10,000 gで10分間遠心分離した。 放出された N-グリカンを含む上清を新しいチューブに移し、Speed-Vac 濃縮器を使用して完全に乾燥させました。 乾燥サンプルは、蛍光分析のためにプロカインアミドで標識されました。 標識された N-グリカン サンプルは、UPLC/MS-MS を使用して分析および定量されました。 N-グリカンの分離と検出には、蛍光検出器 (Waters iClass UPLC) を備えた ACQUITY UPLC BEH グリカン カラム (1.2 × 150 mm、1.7 μm; Waters、デラウェア州ニューキャッスル) を使用しました。 LC 条件は次のとおりです: 流速 (0.5 mL/min)、カラム温度 (60 °C)、移動相バッファー A (100 mM ギ酸アンモニウム、pH 4.5)、バッファー B (100% アセトニトリル)、注入量 (8 mL)、直線勾配 (75 ～ 60% B で 46.5 分間、60 ～ 0% B で 1.5 分間、0% B で 1 分間、0 ～ 75% B で 1 分間、および 75% B で 13 分間)。 高分解能質量分析計、トリプル TOF MS (AB SCIEX、カナダ、オンタリオ州コンコード) を N-グリカンの同定に使用しました。 N-グリカンの分布は Empower (Waters) を使用して分析されました。

精製したrhIgG1 FcおよびCHO細胞由来の組換えEPO（カタログ番号100-64、Peprotech）を糖タンパク質変性緩衝液（New England Biolabs、イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国）中で100℃で10分間インキュベートしました。 次に、製造業者のプロトコールに従ってPNGase F (New England Biolabs)を添加することによりサンプルを切断した。 精製され脱グリコシル化されたrhIgG1 Fcを10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、レクチンブロッティングのためにポリフッ化ビニリデン膜(Millipore)に移した。 膜を、トリス緩衝生理食塩水（２０ｍＭトリス、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５；ＴＢＳ）中の３％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、４℃で一晩ブロックした。 続いて、メンブレンを 1.0 μg/ml のビオチン化レクチン SNA/EBL (ɑ2,6-SA 特異的; Vector Laboratories、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国) および MAL II (ɑ2,3 SA 特異的; Vector Laboratories) とともに TBST 中でインキュベートしました ( 0.05% Tween 20 を含む TBS) で 1 時間処理します。 TBST緩衝液で2回洗浄した後、膜をホースラディッシュペルオキシダーゼ結合アビジン(VECTASTAIN ABCキット; Vector Laboratories)とともに1時間インキュベートした。 メンブレンをTBST緩衝液で洗浄し、ECLウェスタンブロット検出試薬(GE Healthcare Bio-Sciences)を用いて染色を行った。

SPR 分析のために、IVIG を GC pharma (Yong-in, Korea) から購入しました。 ヒト FcγR は、Sino Biological Inc (北京、中国) から購入しました (FcγRIA-10256-H08H; FcγRIIA 167 Arg-10374-H08H; FcγRIIIA F176V-10389-H08H1; FcRn-CT009-H08H; DC-SIGN-10200-H01H)。 rhIgG1 Fcは、幼若ALB::hIgG1 Fcニワトリ血清から精製されました。 SPR 分析は、Biacore T200 (GE Healthcare、米国イリノイ州シカゴ) を使用して実行されました。 FcγRはCM5センサーチップ(BR-1005-30、GE Healthcare)上に固定化された。 IVIG および rhIgG1 Fc を、FcγR でコーティングされたセンサーチップに注入しました。 動態アッセイは、FcγRIA、FcγRIIA、FcγRIIIA、DC-SIGNについては3倍段階希釈、およびFcRnについては2倍段階希釈によって実施した。 FcγRIA および DC-SIGN については、希釈は 300 nM から開始しました。 FcγRIIAの場合、希釈は20μMから開始しました。 FcγRIIIAの場合、希釈は3μMのIVIGおよび300nMのhIgG1 Fcから開始した。 FcRnについては、500nMのIVIGおよび250nMのrhIgG1 Fcから希釈を開始した。 再生は、FcγRIA、FcγRIIA、FcγRIIIA、DC-SIGNについては10mMグリシン、FcRnについては100mM Tris-HClを注入することによって行った。 IVIG および rhIgG1 Fc の FcγR への単量体結合の解離定数 (KD) は、FcγRIA、FcγRIIA、FcγRIIIA の単一サイクル速度論モデルおよび FcRn、DC-SIGN の多サイクル速度論モデルによって計算されました。

ADCC アッセイは、ADCC Reporter Bioassay Complete Kit (G7014、Promega、米国ウィスコンシン州マディソン) を製造業者のプロトコールに従って使用して実行しました。 簡単に説明すると、CD20 陽性 WIL2-S 細胞を RPMI 1640 および低 IgG ヒト血清に再懸濁し、遺伝子操作された FcγRIIIA 発現エフェクター Jurkat T 細胞を含む不透明な 96 ウェル培養プレートにウェルあたり 10,000 細胞で播種しました。 これらの遺伝子操作されたジャーカット T 細胞は、NFAT 応答要素によって発現が駆動されるルシフェラーゼ レポーター遺伝子も持っています。 次に、IVIG (GC pharma) または rhIgG Fc および段階希釈した抗 CD20 抗体を添加し、37 °C、5% CO2 で 6 時間インキュベートしました。 FcγRIIIA の架橋と NFAT シグナル伝達の活性化は、Bio-Glo ルシフェラーゼ アッセイを使用して測定され、マイクロプレート リーダーで測定されました。

ADCPアッセイは、ADCP Reporter Bioassay Complete Kit (G9901、Promega)を製造業者のプロトコールに従って使用して実施した。 簡単に説明すると、CD20陽性Raji細胞をRPMI 1640および低IgGヒト血清に再懸濁し、遺伝子操作されたFcγRIIA発現エフェクターJurkat T細胞を含む不透明な96ウェル培養プレートにウェルあたり10,000細胞で播種した。 これらの遺伝子操作されたジャーカット T 細胞は、NFAT 応答要素によって発現が駆動されるルシフェラーゼ レポーター遺伝子も持っています。 次に、IVIG または rhIgG Fc および段階希釈した抗 CD20 抗体を添加し、37 °C、5% CO2 で 6 時間インキュベートしました。 FcγRIIA の架橋と NFAT シグナル伝達の活性化は、Bio-Glo ルシフェラーゼ アッセイを使用して測定され、マイクロプレート リーダーで測定されました。

8週間の雌C57BL/6マウスをin vivo実験に使用した。 実験を開始する前に、各マウスの尾静脈から血液サンプルを採取した。 血小板を１％ブリリアントクレシルブルー溶液で染色し、光学顕微鏡下で血小板数を計算した（０時間のＰＬＴ数）。 その後、1 g/kg、0.33 g/kg、および0.12 g/kg 用量のIVIG (GC pharma)、および0.33 g/kg、0.12 g/kg、および0.033 g/kg 用量のrhIgG1 Fcを腹腔内(ip)に注射した。空洞。 ＩＶＩＧおよびｒｈＩｇＧ１ Ｆｃ注射の２時間後、抗血小板抗体ＭＷＲｅｇ３０（０．１μｇ／ｇ）を腹腔内注射した。 MWReg30 の 4 時間後、尾静脈から血液を抽出し、1% ブリリアント クレシル ブルー溶液を使用して血小板染色を実行し、光学顕微鏡下で血小板数を計算しました (4 時間の PLT カウント)。 残存血小板数のパーセンテージは、4 時間の PLT カウントを 0 時間の PLT カウントで割って計算されました。

各マウスの脾臓を、ＰＢＳ、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）およびｒｈＩｇＧ１ Ｆｃ（０．３３ｇ／ｋｇ）注射の６時間後に採取した。 マウス Treg Detection Kit (130-120-674、Miltenyi Biotic、Bergisch Gladbach、ドイツ) を使用して脾臓細胞を染色しました。 細胞を、APC標識抗マウスCD25抗体およびVio-Blue標識CD4抗体で冷蔵下30分間染色した。 次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、透過処理し、固定／透過処理溶液を使用して暗所で冷蔵下で３０分間固定した。 2回洗浄した後、細胞をPE標識抗マウスFoxp3抗体で暗所、冷蔵下で30分間処理した。 染色された細胞をフローサイトメーター（BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ）で実行し、データをFlowJoソフトウェア（Tree Star、オレゴン州アッシュランド）を使用して分析した。

各マウスの脾臓を、ＰＢＳ、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）およびｒｈＩｇＧ１ Ｆｃ（０．３３ｇ／ｋｇ）注射の６時間後に採取した。 メーカーのプロトコールに従って TRIzol 試薬 (Molecular Research Center, USA) を使用して脾臓サンプルから全 RNA を抽出し、Superscript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen) を使用して cDNA を合成しました。 PCR 混合物には、2 μL の PCR バッファー、1 μL の 20 × EvaGreen qPCR 色素 (Biotium、Hayward、CA、USA)、0.4 μL の 10 mmol/L dNTP 混合物、およびそれぞれ 10 pmol の遺伝子特異的なフォワードおよびリバース プライマーが含まれていました。 (補足表 3)。 RT-qPCR は 3 回実行されました。 相対的な標的遺伝子発現は、内因性対照としてのマウスグリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) 発現に対して正規化した後に定量化されました。

半減期分析のために、卵黄から精製したrhIgG1 FcおよびHEK293細胞由来の組換えFc(10702-HNAH、Sino Biological Inc)を、100μg/マウスの用量で8週間の雌C57BL/6マウスに腹腔内注射した。 注射の 24 時間後、尾静脈を介して 5 日間血液を収集し、遠心分離によって血清を取得しました。 卵黄から精製したrhIgG1 FcおよびHEK293細胞由来の組換えFcの血清濃度を、ヒトIgG ELISAキット(Abcam)を用いたELISAにより測定した。 半減期は非線形回帰分析によって計算されました。

各実験は、再現性のために少なくとも 3 つの生物学的に独立したサンプルと動物を使用して実行され、統計分析は GraphPad Prism (GraphPad Software、La Jolla、CA、USA) を使用して実行されました。 2 つ以上のグループ間の有意差は、ボンフェローニの多重比較検定を使用した一元配置 ANOVA 分散分析によって決定されました。 2 つのグループ間の統計分析は、対応のある t 検定によって分析されました。 データは平均値 ± 標準偏差値として表されました。 P < 0.05 の値は統計的有意性を示しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

現在の研究中に生成された、および/または研究中に分析されたデータセットは、図、表、および補足情報で見つけることができます。 本文のグラフの生成に使用されるソース データは補足データ 1 で入手できます。未処理のゲル画像は補足図 5 で見つけることができます。他のすべてのデータは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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この研究は、韓国政府 (MSIT) [NRF-2015R1A3A2033826] によって資金提供された韓国国立研究財団 (NRF) 助成金によって支援されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Jin Se Park、Hee Jung Choi。

ソウル国立大学農業バイオテクノロジー学科および農業生命科学研究所（韓国、ソウル）

ジン・セ・パク、ヒ・ジョン・チェ、ギョン・ミン・ジョン、ギョン・ユン・イ、ジ・ヒョン・シム、キョン・ジェ・パク、ヨン・ミン・キム、ジェ・ヨンハン

Avinnogen Co., Ltd.、大韓民国ソウル市冠岳区冠岳路1

パク・ジンセ＆キム・ヨンミン

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JYH は研究デザインと全体的な調整に参加しました。 JSP は研究設計に参加し、実験、データ解釈を実施し、原稿の初稿を書きました。 HJC は実験、データ解釈を実施し、原稿の初稿を書きました。 KMJ、KYL、JHSが実験を実施しました。 KJPは実験動物の管理を行った。 YMKとJYHはデータ解釈を行い、原稿の最終版の作成に携わりました。

ジェヨンハンさんへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Eve Rogers と Anam Akhtar。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Park、JS、Choi、HJ、Jung、KM 他ゲノム編集ニワトリを使用した、抗炎症活性に有益な N-グリコシル化パターンを持つ組換えヒト IgG1 Fc の生産。 Commun Biol 6、589 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04937-5

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受信日: 2022 年 4 月 28 日

受理日: 2023 年 5 月 12 日

公開日: 2023 年 6 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04937-5

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