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Communications Biology volume 6、記事番号: 583 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細胞化学をナノスケールで画像化できることは、細胞生物学を理解する上で鍵となりますが、多くの光学顕微鏡は～(200～250)nmの回折限界によって制限されています。電子顕微鏡法と超解像蛍光技術はこの限界を超えていますが、画像のコントラストを生成するには染色と特殊な標識に依存しています。したがって、細胞内成分の機能化学に関する情報を得るのは困難です。ここでは、ナノスケール (~30 nm) の分解能で細胞内ラベルフリー化学マッピングの手法を実証します。私たちは、生体分子内に発生する官能基の振動モードを励起する波長の中赤外レーザーで照射されたプローブベースの光学顕微鏡を使用します。実証として、ヒト多発性骨髄腫細胞の細胞内構造を化学的にマッピングし、その形態を同じ細胞株の電子顕微鏡写真と比較します。また、疾患や薬理学の研究において生化学マーカーを同定するために使用できる方法で、タンパク質や核酸の化学的特徴をターゲットにするために選択された波長でのラベルフリーマッピングも実証します。

超微細構造を知るための標準的な方法である電子顕微鏡 (EM) では、重金属で染色したサンプルを使用して電子吸収コントラストと電気伝導度を生成します。通常、真空中での電子衝撃に耐えられるよう、数日かかるプロセスで樹脂に埋め込まれます。さらに、非常に特異的な免疫標識がない場合、EM 画像は形態学的情報のみを提供し、染色を取得した超微細構造の特徴のみを明らかにします。

さまざまな超解像蛍光顕微鏡も細胞構造のサブ回折イメージングを可能にします 1,2 が、いずれも当面の問題に特有の標識を必要とし、多くの場合、効果的な標識のために構造に関する先験的な知識に依存します。実際には、蛍光色素の光退色、および安定性と特異性の問題により、標識の位置を特定できる精度が制限されます。たとえそのような技術的課題が克服されたとしても、構造の位置を特定する能力は、使用される蛍光標識と連結分子の長さによって設定される標的構造と蛍光団の間の距離によって制限されます。通常、これらの長さはそれぞれ数ナノメートルです3。重要なことに、標識によってサンプルの生物学が乱されるリスクもあります1。

赤外 (IR) 分光法とイメージングは、ラベルフリーの定量的な化学情報を取得するために広く使用されていますが、回折限界により、一般に細胞内レベルでのイメージングは不可能です。この限界を超えるために、原子間力顕微鏡 (AFM) のナノスケール分解能と IR 分光法の化学感度を組み合わせた、いくつかのプローブベースのイメージング技術が開発されました 4,5。当社では散乱型走査型近接場光学顕微鏡 (s-SNOM) を使用しており、AFM プローブは調整可能な IR レーザーで照射されます。チップとサンプルが相互作用する小さな領域から後方散乱した IR 光を収集して分析することにより、その領域におけるサンプル材料の IR 吸収特性を推測することができます。レーザーを調整することで、染色や標識を必要とせずに化学的特異性を備えた画像を得ることができます。重要なのは、生体物質そのものを画像化することです。これまで光で直接画像化されたことのない超微細構造特徴を検出し、EMでは現れない新たな細胞内構造を発見できる可能性を高めます。

s-SNOM はこれまで、タンパク質複合体 6、7、8、ウイルス 9、アミロイド線維 10 などの単離された生物学的標本のイメージングや、細胞全体の表面イメージング 11、12、13 に使用されてきました。細胞および組織の細胞内構造も、それぞれ単細胞生物 14 およびゼブラフィッシュ網膜組織 15 で画像化されています。今回我々は、著者らの知る限りでは、小胞体（ER）、ミトコンドリア（Mt）、核小体の原線維成分の初の直接光学サブ回折画像を含む、ヒト多発性骨髄腫細胞の細胞内構造を化学的にマッピングすることでこれを構築する。照明波長を変化させて細胞内のさまざまな化学基をターゲットにすることにより、従来は高度に特異的な標識でのみ達成されていた超微細構造の分離も実証します。

私たちの s-SNOM セットアップ (図 1) では、中赤外量子カスケードレーザー (QCL) が鋭利な導電性プローブを照射し、いわゆる避雷針効果により、その先端に強化された非常に局所的な光場を確立します16。、17．サンプルの存在によりこの場が変化し、サンプルの局所的な IR 吸収特性が後方散乱光から回復できるようになります 18。特に、ここで調査した振動モードのような弱い発振器の場合、後方散乱光の位相は複素屈折率の減衰項に比例するため、特定のイメージング波長での遠視野吸収係数にも比例します19。重要なのは、画像の空間解像度は光の波長ではなくプロービングチップのサイズによって決まり16,20、これにより \(\sim\)6 μm のイメージング波長では通常 2 桁の大きさで回折を上回ることができます。。

赤外 (IR) 量子カスケードレーザー (QCL) 光は、ビームスプリッター (BS) で 2 つのアームに分割されます。一方のアームは、放物面鏡 (PM) を使用して、サンプル上で周波数 Ω で振動する鋭い金属プローブに焦点を合わせます。もう一方のアームは振動ミラー (VM) によって周波数 M で位相変調され、参照ビームとして機能します。サンプルが圧電ステージ上でラスタースキャンされている間に、プローブと参照ビームからの後方散乱光がテルル化水銀カドミウム (MCT) 検出器で検出されます。サンプルの光学特性は後方散乱光から復元されます。

ここで、多発性骨髄腫細胞は重要な病理メカニズムが個々の細胞レベルで発生する重要なヒト疾患の一例であり 21、我々のアプローチに特に適しているため、この技術を多発性骨髄腫細胞に適用することを選択しました。これらは、透過型 EM (TEM) についてもよく研究されています 22,23。細胞は固定され、エポキシ樹脂に包埋され、(70 ～ 200) nm に切片化されますが、ラベルフリーイメージングを可能にするために浸透圧を与えずに残されます。 s-SNOM イメージングに使用されるセクションは、反射率によって信号が向上し、画質が向上するシリコン基板上に配置されます24。セクションの厚さの選択と反射基板の効果の詳細については、それぞれ補足ノート 1 と補足ノート 2 に記載されています。 s-SNOM 画像のベンチマークを行うために、追加の細胞切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で後染色し、TEM で画像化します。

この技術にとって重要なのは、擬似ヘテロダイン検波方式です25。検出器で測定された信号は、プローブ発振周波数 Ω の高調波で分析され、振動参照ミラーの位相変調周波数 M によって分離された側波帯に分割されます。この論文に示されている画像には、プローブ発振周波数の 3 次高調波が使用されています。これにより、表面感度が高く、バックグラウンドのない位相測定 \({\phi }_{3}\) が得られます。一般に、低次高調波はバックグラウンド信号によって汚染され、高調波はより低い信号対雑音比を示すため、第 3 高調波が選択されます。完全を期すために、利用可能な各高調波 n で収集された一連の画像を補足図 1 に示します。位相測定に加えて、s-SNOM システムは光振幅とサンプルのトポグラフィ測定も取得します。これらの量の代表的なマップとそれらに含まれる情報の説明は、補足図2に提供されます。

図2aは、タンパク質や核酸塩基に存在するアミド部分の振動モードを励起する波長である1667 cm-1で取得した骨髄腫細胞のs-SNOM画像です。測定された位相シフト \({\phi }_{3}\) はサンプルの吸収に比例し、したがってこの波長ではアミド密度に比例します。得られた化学マップの形態学的特徴により、核膜 (NM) で輪郭を描かれ、核小体 (Nuc) を含む多葉の核を含むいくつかの細胞内構造の同定が可能になります。同様の超微細構造特徴が骨髄腫細胞の TEM 画像でも観察され (図 2b)、構造の同定を裏付けています。

タンパク質および核酸塩基のアミド基を標的とした、1667 cm-1で取得された骨髄腫細胞のs-SNOM化学マッピング。挿入図 a(i) および a(ii) は、高解像度の s-SNOM 画像です。 b、c 酢酸ウラニルとクエン酸鉛で後染色したが、浸透圧を与えずに放置した骨髄腫細胞の TEM。挿入図 c(i) および c(ii) は構造をより詳細に示しています。 d a(ii)の赤い線に沿ったs-SNOM信号の空間プロファイル。 NM核膜、Nuc核小体、ER小胞体、Mtミトコンドリア。スケールバー 2 μm (a、b)、1 μm (c)、および 500 nm (a(i)、a(ii)、c(i)、c(ii))。

最高レベルのアミド吸収は核小体で起こります。これは、フィブリラリン、ヌクレオリン、ヌクレオフォスミンなどの多くのタンパク質に依存するリボソーム生合成の部位です26、27、28。核膜にはタンパク質も多く含まれているため 29、化学マッピングでは高いアミド吸収を示します。核膜内の顆粒パターンはクロマチンであり、ヒストンタンパク質の周りにしっかりと巻き付いた DNA で構成されています 30。

より高解像度の s-SNOM 画像 (図 2a (i および ii)) では、ER および Mt として識別される構造が明らかになり、タンパク質と核酸の含有量によりこの波長で可視化されます 31,32。同様の形態が図2c（iおよびii）のERおよびMtのTEM画像でも観察され、再び我々の同定を裏付けています。

図2dは、ミトコンドリアの端を横切る図2aiiの赤い線に沿ったs-SNOMシグナルのラインスキャンを示しています。空間プロファイルは 6 nm (3 ピクセル) の幅にわたって平均され、約 30 nm の空間解像度を示します。このレベルの空間解像度は、これらの生体サンプルで日常的に達成されます（補足図3）が、イメージング技術をさらに最適化することでこの解像度が向上すると期待されます。たとえば、より鋭利な特注プローブを使用した無機試料では、最大 5 nm までの s-SNOM 分解能が報告されています 33。

図 3a は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）プロトコルで調製され、1 μm の厚さに切片化され、その後測定された吸収が影響を受けないように脱パラフィン処理された骨髄腫細胞切片の遠視野吸収スペクトルです。埋め込み媒体からの貢献。この遠視野吸収スペクトルを使用して、s-SNOM による化学マッピングの波長の選択を決定します。

a 脱パラフィン処理したホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 骨髄腫細胞切片の吸収スペクトル。 b（i – iv）（a）に示されている各バンドの波長で取得された単一の骨髄腫細胞のs-SNOM画像。スケールバーは2μm。

アミド I および II の吸収バンドは、アミド部分によって示される多くの振動モードの集合体であり、s-SNOM を用いたナノスケール研究を含む、サンプルのタンパク質含有量を分析するための IR 分光法で日常的に使用されています 10,14。ホスホジエステル (PO2) バンドは、核酸およびリン脂質の主鎖に見られる PO2 部分に対応します。その相対濃度は、癌の信頼できるバイオマーカーとして使用できます 35。 C-O とラベル付けされたバンドは、主に、脂質や炭水化物だけでなく、核酸の五炭糖であるリボースの C-O 振動モードで構成されています。さまざまな高分子も異なる細胞領域の PO2 および C-O バンドでの吸収に寄与している可能性がありますが、これらはどちらも核領域の核酸含有量の分析に日常的に使用されています 34。細胞をキシレンで除去すると、脂質含有量の多くが細胞から除去されることに注目します。これは、約 1730 cm-1 に吸収ピークがないことを説明します。完全を期すために、s-SNOMイメージングに使用される樹脂包埋骨髄腫細胞の吸収スペクトルを補足図4に示します。

図 3b は、図 3a の 4 つの吸収ピークのそれぞれを表す波長での単一骨髄腫細胞の化学マッピングを示しています。図 3bi のアミド I ピークは、核酸塩基からの寄与もありますが、主に細胞全体のタンパク質密度をマッピングする手段として機能します。細胞内にタンパク質が遍在しているため、この波長では弱くしか吸収しない包埋樹脂と比較して、細胞全体が強い吸収を示します。

図2aに示すように、最も強い吸収は、核小体や核膜などのタンパク質が密集した構造で見られます。図 3bii もアミド含有構造をマッピングしていますが、ここではアミド II バンドの波長を使用しています。同じ構造がセル内に見られますが、図 3a の吸収スペクトルのピーク高さの違いに対応して、全体的な吸収レベルが低くなります。

図 3b (iii と iv) は、それぞれ PO2 バンドと C-O バンドの波長で取得された化学マップです。どちらの波長でも、核膜の近くおよび核小体の周縁部で強い吸収が見られますが、これは主にクロマチンに高密度にパッケージされた核酸によるものであると考えられます30。細胞質と核小体は、1020 cm-1 よりも 1235 cm-1 でより大きな吸収を示します。我々はこれをリン脂質の存在によるものと考えています 29。リン脂質は 1235 cm-1 で多くの振動モードが活性ですが、C-O バンドの端の 1020 cm-1 でははるかに少なくなります 34。したがって、我々は、1020 cm-1 が核酸の単離に適したイメージング波長であると推測しています。

アミドIおよびC-Oバンドのイメージング波長を使用した高分解能化学マップをそれぞれ図4a、bに示します。この細胞は、多発性骨髄腫細胞で頻繁に観察されるように、二核であるようであり 36、37、38、39 、図 4a に見られる 2 つのタンパク質密度の高い核小体と核膜が見られます。核小体の 1 つの高倍率画像 (図 4a (i)) には、アミド密度が低い領域を取り囲むアミド密度が高いいくつかの馬蹄形の構造が示されています。我々はこれらをそれぞれ高密度原線維成分（DFC）および原線維中心（FC）として識別します40。核小体の残りの部分は顆粒成分で構成されています40。核小体の高倍率 TEM 画像（補足図 5）にも DFC と FC が示されており、私たちの同定を裏付けています。 s-SNOMで取得された核小体の追加の高倍率画像を補足図に示します。興味深いことに、DFC は図 4b (i) では見られず、1020 cm-1 の波長でほとんど吸収を示さないことを示唆しています。これは、図4cで、1つのDFCにわたる両方のイメージング波長でのs-SNOM信号の空間プロファイルによって確認されます（図4a（i）のマゼンタ線）。

アミド I (a) および C-O (b) バンドのイメージング波長による単一骨髄腫細胞の s-SNOM 化学マッピング。挿入図 a(i) および b(i) は構造をより詳細に示しています。 FC 線維中心、DFC 高密度線維成分。両方のイメージング波長におけるマゼンタ (c) および緑 (d) の線に沿った s-SNOM 信号の空間プロファイルは、75 nm (5 ピクセル) の幅にわたって平均化されました。スケールバーは 3 μm (a、b) および 500 nm (a(i)、b(i))。

注目すべきことに、図4b(i)のシアンの矢印で示される核酸密度の高い領域もありますが、図4a(i)のアミドマッピングでは検出されず、それらの領域のアミド密度が低いことを示唆しています。これは、図4dで、図4b(i)の緑色の線に沿ったs-SNOM信号の空間プロファイルによって確認されます。この方法で細胞構造のサブセットを分離するさらなる例を補足図に示します。補足の図8では、包埋樹脂のIRシグネチャが化学的特異性でイメージングする能力を著しく損なうことがないことを示しています。

我々は、s-SNOMを使用して、ナノスケールのプローブベースのイメージングとIR分光法の化学感度を組み合わせて、真核細胞のラベルフリー化学マッピングを実行しました。細胞の化学マップの形態を検査することで、多くの細胞内構造を特定し、それらをサポートするTEM画像と比較することでこれを検証しました。著者の知る限り、この論文は、ER、Mt、DFC、および核小体の線維中心の最初の直接光学サブ回折画像を提供します。

これに加えて、私たちは、よく理解され広く使用されている IR シグネチャをターゲットにして、細胞内のタンパク質と核酸をマッピングしました。これにより、タンパク質が豊富な DFC や核小体中の核酸含量の高い領域など、細胞の超微細構造のサブセットを単離することが可能になりました。

細胞内構造の数、サイズ、化学組成の定量化は、顕微鏡検査の重要な側面です。これは超解像蛍光技術で標識細胞を使用することで可能ですが、標識密度は観察される構造の数とその見かけのサイズの両方に影響を与えることが示されています41。一方、s-SNOM のラベルフリーの性質は、化学マッピングが完全に定量的であり、そのようなラベル付けのバイアスがないことを意味します。さらに、s-SNOM 信号から屈折率などの一般的に使用される光学パラメータへの変換も、画像処理アルゴリズムを通じて可能です13。

私たちは、定量的な細胞内イメージングのこの能力は、疾患のナノスケールのバイオマーカーの発見に大きな可能性をもたらすと考えています 42 だけでなく、幅広い治療薬、特にボルテゾミブやオシメルチニブ 43 などの薬剤の有効性と作用機序の特徴付けも可能です。 s-SNOM で悪用できる化学的特徴。 s-SNOM と光学顕微鏡の相関はすでに実証されており 15、現在の技術を応用することでさらに EM と相関させることも可能であると期待されています 44,45。したがって、我々は、s-SNOM が EM および超解像蛍光技術を補完して、NETosis などの免疫応答を含むさまざまな研究分野における細胞メカニズムの理解を助けることができると期待しています46。

約 6 µm の動作波長では、約 30 nm の分解能はすでに回折限界よりも約 100 倍優れています。 s-SNOM で達成可能な最大空間分解能は走査プローブ 20 の先端のサイズに関係しているため、より鋭い先端を使用すると、画像の S/N 比には悪影響を及ぼしますが、より高い分解能が期待できます。たとえば、IR ナノアンテナ 8 やチップ強化技術 47 の採用など、s-SNOM イメージングの感度向上につながる開発は、この信号対雑音比の問題を軽減するのに役立つ可能性があります。また、形態学的情報と化学的情報の両方をよりよく保存するサンプル前処理スキームを実験することで、画像解像度が無機サンプルで報告されている ~1 nm に向かって向上することが期待されます 48。

s-SNOM は周囲条件で、わずか数ミリワットの IR 出力で実行されるため、サンプルを樹脂に包埋する必要がなく、この技術は FFPE スタイルのセクションのイメージングに適しているはずです 42。後者は、EM サンプルの数分の 1 の時間とコストで組織病理学用に日常的に準備されています。これは、ワークフローを変更せずに組織病理学者に超微細構造情報への日常的なアクセスを提供することで、疾患マーカーのモニタリングを劇的に改善できる重要な臨床応用につながる可能性があります。

RPMI-8226 細胞は、Zlei et al.49 が実施したように、10% ウシ胎児血清、ペニシリン (100 U/mL)、およびストレプトマイシン (100 μg/mL) を補充した RPMI 1640 培地で増殖させました。細胞は American Type Culture Collection から購入し、ショートタンデムリピート解析によって毎年検証され、3 ～ 4 か月ごとにマイコプラズマのスクリーニングが行われました。

RPMI 細胞の s-SNOM および TEM イメージングを実行するために、25 × 106 個の細胞をペレット化し、0.1 m の 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES) 緩衝液 (pH 7.2) で洗浄し、2.5% グルタルアルデヒドで固定しました。 HEPES を 4 °C で 2 時間洗浄し、HEPES で 10 分間 3 回洗浄しました。その後、ペレットを段階的エタノール濃度(50%、70%、95%、および乾燥100% v/v)で3×5分間、続いてアセトニトリル(Sigma-Aldrich、英国)中で3×10分間脱水した。次に、サンプルに Quetol 樹脂 (Sigma) の 50%、75%、および 100% のアセトニトリル溶液を室温で徐々に浸透させました (2 時間 × 50% 樹脂、一晩 × 75% 樹脂、および 100% 樹脂の 2 回の交換) 3 日間)、60 °C で 24 時間硬化させました。選択したサンプルを、両方とも再蒸留水で調製した 5% 酢酸ウラニル (UA、5 分) およびクエン酸鉛 (LC、3%、5 分) で後染色しました。埋め込まれたペレットを、35° ダイヤモンドナイフ (Diatome、スイス) を備えた Leica UC7 ウルトラミクロトーム (Leica、オーストリア) を使用して、(70 ～ 200) nm の厚さに切断しました。切片はすぐに炭素コーティングされた TEM 銅グリッド (Agar Scientific、英国) またはシリコンウェーハチップ (NanoAndMore) 上に収集され、乾燥してさらに使用するまで保管されました。

遠視野吸収スペクトルを取得するために、RPMI-8226 細胞を標準の FFPE プロトコルで調製しました。 22°ステンレス鋼ブレード (S22、フェザー、日本) を備えた Leica 1400 ミクロトーム (ライカ、ドイツ) を使用して、切片を 1 μm の厚さに切断しました。切片をフッ化カルシウムスライド上に置き、キシレン (2 × 3 分)、続いてエタノール (100%、2 × 3 分) で脱パラフィンしました。

\(\sim\)(900–1900) cm のスペクトル範囲をカバーする 4 つのレーザーチップを備えた QCL システム (MIRcat-QT、Daylight Solutions、米国) を備えた商用近接場顕微鏡システム (neaSNOM、NeaSpec、ドイツ) -1 は s-SNOM イメージングに使用されました。擬似ヘテロダイン検出方式 25 を使用して、バックグラウンドのない位相測定を取得しました。共振周波数 \(\sim\)285 kHz の市販のプローブ (Arrow NCPt、スイス、NanoWorld) を、振幅 \(\sim\)50 nm のタッピングモードで駆動しました。 Gwyddion は、ラインノイズ補正や画像データからのラインプロファイルの抽出などの基本的な画像処理に使用されました。

骨髄腫細胞の TEM イメージングは 120 kV で実行されました (JEOL 2100 TEM、日本電子)。

骨髄腫細胞の遠視野吸収スペクトルは、Hyperion IR 顕微鏡を取り付けた市販のフーリエ変換 IR 分光計 (Vertex 70、Bruker、USA) を透過モードで操作して取得しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

s-SNOM および TEM 画像は、BioImage Archive リポジトリでアクセッションコード S-BIAD612 で入手できます。生の吸収スペクトルデータは https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22277086.v1 で入手できます。補足情報は別の文書で提供されます。

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CCP と GEG は、EPSRC からの財政的支援を認めています (EP/N509486/1、EP/R513052/1)。 HWA は、Cancer Research UK (C41494/A29035) の支援に感謝します。 CCP と DK は、Cancer Research UK (C68186/A28503) の支援を認めます。著者らは、多発性骨髄腫細胞の遠視野吸収スペクトルを取得するために使用される FFPE ブロックを作成した Sandra Iles に感謝します。

インペリアル・カレッジ・ロンドン物理学科実験固体グループ、ロンドン、英国

ジョージ・E・グリーブス、ダリヤ・キリュシュコ、クリス・C・フィリップス

インペリアル・カレッジ・ロンドン、ロンドン、英国、材料学部およびロンドン・ナノテクノロジーセンター

ダリヤ・キリュシュコ & アレクサンドラ・E・ポーター

インペリアル・カレッジ・ロンドン、ヒュー・アンド・ジョセリン・ラングミュア骨髄腫研究センター、免疫学および炎症部門、ロンドン、英国

ホルガー・W・アウナー

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このプロジェクトは CCP と AEP によって考案され、調整されました。 HWA によって提供されたミエローマ細胞は DK によって切片に調製されました。 s-SNOM 画像が取得され、GEG によって分析されました。 TEM 画像は DK ミエローマによって取得されました。 FFPE ブロックは FTIR 分光計で使用するために準備され、その後GEG によって測定この論文は、他の著者の寄稿を受けて GEG によって書かれました。著者全員がこの論文を読んで認めています。

ジョージ E. グリーブスまたはクリス C. フィリップスとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Le Wang、Stefan Stanciu、Xiaoji Xu に感謝します。主な編集者: Chao Zhou と Manuel Breuer。査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Greaves, GE、Ki Ryushko, D.、Auner, HW 他細胞内小器官化学のラベルフリーのナノスケールマッピング。 Commun Biol 6、583 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04943-7

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受信日: 2023 年 1 月 13 日

受理日: 2023 年 5 月 15 日

発行日: 2023 年 5 月 31 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04943-7

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